Bijlage 2 van PVE-SALMONELLA-MSRV-1 40607: Kwaliteitscontrole van batches MSRV
[Regeling vervallen per 01-01-2010]
Deze bijlage beschrijft een methode voor de kwaliteitscontrole van batches MSRV.
Negatieve controle
[Regeling vervallen per 01-01-2010]
Als negatieve controle kan een Escherichia coli stam gebruikt worden.
Kweek de stam op zoals beschreven voor de positieve controle. Maak verdunningen in
BPw tot 105 – 106 cfu/ml.
Volg de procedure zoals beschreven voor de positieve controle.
E. coli dient geen zwerming te vertonen op MSRV.
Opmerking:
Controlestammen zijn onder andere verkrijgbaar bij de VWA in Groningen (www.vwa.nl/chek).
Pve-salmonella-sero-140607
[Regeling vervallen per 01-01-2010]
Toelichting op de serotypering van Salmonella volgens het Kauffmann-White schema.
1. Inleiding
[Regeling vervallen per 01-01-2010]
Voor de serotypering van Salmonella spp. volgens het Kauffmann-White schema (Popoff, 2001) worden door diverse fabrikanten
verschillende voorschriften geleverd.
Voor de juiste wijze van typeren dient dan ook altijd het voorschrift van de fabrikant
gevolgd te worden.
Details over de taxonomie van Salmonella alsmede over de antigene formules van de Salmonella serotypen staan beschreven in Popoff (2001 ). Onderstaande informatie is een korte
toelichting hierop.
De serotypering van Salmonella spp. bestaat uit de volgende stappen:
-
– Selectie van een Salmonella verdachte kolonie (vastgesteld middels biochemische typering);
-
– Onderzoek naar auto-agglutinatie;
-
– Agglutinatie met O-antisera: voor het aantonen van O-antigenen in het Lipopolysaccharide
(LPS) van de bacterie;
-
– Agglutinatie met H-antisera: voor het aantonen van de H-antigenen in de flagellen
van de bacterie.
In het onderstaande stuk wordt de procedure beschreven voor het serotyperen van 6
Salmonella serotypes welke momenteel (2007) regelmatig bij pluimvee worden aangetroffen (zie
ook bijlage 1). Deze 6 Salmonella serotypes betreffen:
Salmonella Typhimurium (1, 4, [5], 12 : i : 1, 2)
Salmonella Paratyphi B var. Java (1, 4, [51, 12 : b : 1, 2)
Salmonella Enteritidis (1, 9, 12 : g, m : -)
Salmonella Infantis (6, 7, 14 : r : 1,5)
Salmonella Virchow (6, 7, 14 : r : .1,2)
Salmonella Hadar (6, 8 : zlo : e, n, x)
2. Selectie van een Salmonella verdachte kolonie
[Regeling vervallen per 01-01-2010]
Kweek een reincultuur van een kolonie welke middels biochemische typering als verdacht
voor Salmonella kan worden beschouwd. Gebruik de kweekmethode en het medium zoals voorgeschreven
door de fabrikant.
3. Onderzoek naar auto-agglutinatie
[Regeling vervallen per 01-01-2010]
Voer het onderzoek naar auto-agglutinatie uit volgens het voorschrift van de fabrikant.
De wijze van onderzoek naar auto-agglutinatie alsmede het aflezen geschiedt op gelijke
wijze als de agglutinatie met O-antisera (zie ook 4. Agglutinatie met O-antisera).
Een voorbeeld voor onderzoek naar auto-agglutinatie is hieronder beschreven.
Breng op een objectglas een druppel zoutoplossing (0,85% NaCl);
Breng met een steriele entnaald bacteriemateriaal in de druppel zodat een lichte melkachtige
suspensie wordt verkregen;
Beweeg het objectglas heen-en-weer (druppel laten zwenken). De tijd van zwenken varieert
per fabrikant van 5 sec tot 60 sec;
Beoordeel de suspensie. De aanwezigheid van klontjes in het preparaat duidt op autoagglutinatie
van de onderzochte stam. De stammen die auto-agglutinatie vertonen kunnen niet verder
onderzocht worden voor serotypering.
Controleer voor gebruik of de antisera (O en H) helder zijn. Indien troebeling zichtbaar
is volg dan de aanwijzingen van de fabrikant.
Opmerking: Bewaar goed getypeerde Salmonella stammen van ringonderzoeken om antisera te testen.
4. Agglutinatie met O-antisera (of monoclonale antilichamen)
[Regeling vervallen per 01-01-2010]
Voor het aantonen van de 6 bovengenoemde Salmonella serotypes worden de volgende O-antisera gebruikt (in volgorde van de hierboven genoemde
serotypes):
Begin de agglutinatie met O:4 antiserum. Levert dit een negatief resultaat op, test
dan met O:9 antiserum. Levert dit ook een negatief resultaat op test dan met O:7 antiserum.
Levert dit ook een negatief resultaat op test dan met O:8 antiserum.
Volg voor de uitvoering en het aflezen van de agglutinatiereactie strikt het voorschrift
van de fabrikant.
Een aantal fabrikanten gebruikt een objectglas methode voor het agglutineren. Daarbij
wordt een druppel antiserum gemengd met bacteriemateriaal (direct vanaf plaat of vanuit
een bacteriesuspensie) op het objectglas, zodanig dat een lichte melkachtige suspensie
wordt verkregen. Het objectglas wordt vervolgens heen-en-weer bewogen (druppel laten
zwenken).
Vervolgens wordt de reactie afgelezen. De aanwezigheid van klontjes in het preparaat
duidt op een positieve reactie. Per fabrikant kunnen o.a. de volgende zaken verschillen:
-
– Grootte van de druppel op het objectglas (bijv. ‘25 µl’ of ‘een druppel’);
-
– Wijze van opbrengen van antiserum en bacteriemateriaal op het objectglas (bacteriemateriaal
direct vanaf agar of via een suspensie toevoegen aan een druppel antiserum op het
objectglas of antiserum toevoegen aan een druppel ‘bacteriesuspensie’, op het objectglas);
-
– Zwenktijd van het objectglas (kan variëren van 5 sec tot 60 sec);
-
– Wijze van aflezen van het resultaat (met blote oog, met vergrootglas, tegen een donkere
achtergrond, etc.);
-
– Interpretatie van de resultaten (lees met name de voetnoten m.b.t. de beperkingen)
.
5. Agglutinatie met H-antisera (of monoclonale antilichamen)
[Regeling vervallen per 01-01-2010]
Na het agglutineren met O-antisera, vindt de agglutinatie met H-antisera plaats.
Salmonella bezit vaak twee typen H-antigeen (fase 1 en fase 2). Indien bij difasische stammen
één H-fase negatief wordt gevonden, dient de tweede fase aangetoond te worden middels
een fase-inversie methode. Bij fase-inversie wordt het dominante H-antigeen onderdrukt
zodat het 2e H-antigeen tot expressie kan komen en kan worden aangetoond.
Het medium dat hiervoor gebruikt wordt dient zodanig te zijn dat Salmonella hier goed in kan bewegen. Een voorbeeld van een dergelijk ‘zwerm medium’ is Sven
Gard agar.
Een voorbeeld van een fase inversie methode wordt onder 6. beschreven.
Volg voor zowel het opkweken van de stam als voor het uitvoeren en het aflezen van
de agglutinatiereactie met H-antiserum de voorschriften van de fabrikant.
Gebruik de volgende H-antisera voor het aantonen van de 6 hierboven genoemde Salmonella serotypes.
O:4 positief
[Regeling vervallen per 01-01-2010]
Agglutineer met H:i én H:2 antisera. Indien beiden een positief resultaat opleveren
dan is de uitslag: Salmonella Typhimurium.
Voor Salmonella Paratyphi B var. Java dient de agglutinatie met H:b én H:2 antisera positief te zijn.
O:9 positief
[Regeling vervallen per 01-01-2010]
Test met H:G(complex) antiserum. Indien dit een positief resultaat oplevert, test
dan vervolgens met H:m antiserum. Indien dit ook een positief resultaat oplevert voer
dan een negatieve controle uit op H:g, H:s en H:t antisera. Indien het resultaat als
volgt is:
H:G : + , H:m : + , H:g : -, H:s : - en H:t : -, test dan met 0:46 of met O:12 (O:2,12
of O:4, 12) . Indien vervolgens de agglutinatie met O :46 negatief is, of de agglutinatie
met O: 12 positief is, dan is de uitslag: Salmonella Enteritidis.
N.b.: Let op bij de aanschaf van H:G(complex) antiserum dat onderscheid gemaakt kan
worden tussen H:g,m en H:m,t. Bijvoorbeeld: met H:g,p antiserum kan onderscheid gemaakt
worden tussen H:g,m en H:m,t. Echter met een H:g,m antiserum kan dit onderscheid niet
gemaakt worden. Bovendien kan met een H:g,m antiserum geen H:g aangetoond worden bij
H:g,m stammen. Dit kan wel met H:g,p antiserum.
O:7 positief
[Regeling vervallen per 01-01-2010]
Agglutineer met H:r én H:2 én H: 5 antisera.
Indien H:r én H: 5 positief zijn dan is de uitslag: Salmonella Infantis.
Indien H:r én H: 2 positief zijn dan is de uitslag: Salmonella Virchow.
O:8 positief
[Regeling vervallen per 01-01-2010]
Agglutineer met H:z10 én H:x antisera. Indien beiden positief zijn agglutineer dan vervolgens met O:6,7
of met O:61 antiserum. Indien ook O:6,7 of O:61 een positief resultaat oplevert dan is de uitslag: Salmonella Hadar.
N.b.: Let op bij de aanschaf van O:6, 7 antiserum dat dit antiserum ook goed reageert
met O:6,8 stam en (informeer bij de fabrikant).
6. Voorbeeld fase inversie met Sven Gard methode
[Regeling vervallen per 01-01-2010]
Het hieronder beschreven voorbeeld voor een fase inversie methode betreft de serotypering
van Salmonella Typhimurium. In zijn algemeenheid is de methode ook toepasbaar voor andere Salmonella serotypes.
Indien O:4 en H:i positief zijn en H:2 negatief, handel dan als volgt:
Bereid een agarplaat met anti-H:i (bijvoorbeeld Sven Gard serum-mix welke H:i bevat).
Ent de stam op het centrum van deze plaat (volg voorschrift van de fabrikant). Agglutineer
na incubatie met H:2. Indien dit opnieuw een negatief resultaat oplevert, agglutineer
dan opnieuw met H:i. Indien H:i een negatieve of zwakke agglutinatie vertoont dan
is het resultaat geen Salmonella Typhimurium. Indien H:i wel een positieve (sterke) agglutinatie vertoont voer dan
een tweede fase inversie uit. Bereid hiertoe opnieuw een agarplaat met anti-H:i. Neem
bacteriemateriaal van de buitenrand van de eerste fase inversie plaat voor het beënten
van de tweede fase inversie plaat. Herhaal de procedure zoals hierboven beschreven.
7. Bronvermelding
[Regeling vervallen per 01-01-2010]
• Popoff, M.Y, 2001. Antigenic formulas of the Salmonella serovars. WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella. Institute Pasteur, Paris, France.